انضم إلى صفحة يوم جديد على الفيسبوك
لمتابعة أحدث المقالات و تبادل الآراء و الأخبار
للانضمام، اضغط على زرأعجبنى أو Like
خريطة البوابة المعلوماتية موقع خاص لكل مشترك فى كنانة أونلاين مشاركات القراء قاموس متعدد اللغات
      مشروعات صغيرة الزراعة و الإنتاج الحيوانى مهارات و صناعات صحة الأسرة ثقافة عامة و معلومات  

 زراعة الأنسجة
الرجوع إلى المختارات
بقلم: lopez
بتاريخ: 30 سبتمبر 2007
تقييم:
زراعة الأنسجة Tissue Culture
مقدمة :-
يعتبر علم زراعة الأنسجة من المجالات الحديثة الهامة المنتمية حديثاً لعلم الوراثة وهو مجال تطبيقي سوف يحدث ثورة في مجال الزراعة حيث يهتم بتنمية أجراء صغيرة من الأنسجة النباتية Explant والحيوانية يتراوح حجمها تقريباً بين عدة مليمترات إلي ما يقرب من البوصة في الطول علي بيئات صناعية معروفة المكونات وتحت ظروف بيئية متحكم فيها صناعياً ويتم هذا بغرض انقسام ونمو الخلايا وكذلك إعادة التشكل مرة أخرى في هذه الأنسجة لكي يتكون لدينا نمواً من الخلايا Callus أو كائن كامل ] نبات كامل [ ثم يتم نقله وأقلمته للظروف البيئية الزراعية وبذلك يعطي بعض النباتات أو الأصناف ذات مميزات خاصة يستفاد منها استفادة كبيرة في مجال الزراعة وهذا يتم إنجازه في جيل أو جيلين وبذلك لا نلجأ إلي برامج التربية التقليدية التي قد تستغرق من 10 - 15 عام .
وتعتبر الظروف البيئية التي يتعرض لها النسيج من أهم العوامل التي تؤثر علي نجاح عمليات زراعة الأنسجة وهذه الظروف مثل الضوء ( شدته - مدة التعرض له - موجاته ) ودرجة الحرارة ( هل هي ثابتة أو متغيرة حسب الليل والنهار ) والرطوبة ( ملائمة فلا تساعد علي نمو الكائنات الدقيقة وكذلك لا تساعد علي سرعة جفاف البيئة ) .
ولقد حقق المتخصصون في هذا المجال تقدم كبير في زراعة الأنسجة النباتية لما تمتاز به الخلايا النباتية من قدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .
لكن التقدم في مجال زراعة الأنسجة الحيوانية يواجه بعض الصعوبات حيث أن الخلايا الحيوانية ليست لها القدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .
تعريف علم زراعة الأنسجة :-
يقصد بزراعة الأنسجة هو استخدام جزء من النبات قد يكون البذرة أو جزء من الجذر أو جزء من الساق أو جزء من الأوراق أو المتك أو حبوب اللقاح غلي بيئة مغذية غالباً ما تحتوي علي العناصر الكبرى والصغرى ومصدر للسكريات وغالباً ما يستخدم السكروز كبيئة مغذية وأحياناً تضاف بعض من منظمات النمو مثل الأكسينات لتشجيع تكوين الجذور ونموها والسيتكوينيتات لتشجيع نمو الساق والهرمونات التي توجه النبات لتكوين نسيج Callus وهو عبارة عن مجموعة من خلايا منتظمة أو غير منتظمة ونعني بكلمة منتظمة أي أنها خلايا متشابهة لا يمكن تمييز خلايا خاصة بالجذر أو الساق أو الأوراق - وزراعة تلك الخلايا المفككة علي بيئة مغذية يمكن الحصول علي أفراد تشبه النبات الأم الأصلي في تركيبها الوراثي بكميات كبيرة في أوقات قصيرة .
وتتمم هذه الطريقة في ظروف تعقيمية حيث أن البيئات المستخدمة تكون موطن خصب للكائنات الدقيقة .
أهداف استخدام زراعة الأنسجة :-
1 - Rapid clone - Propagation
إكثار النباتات خلال مزارع الأنسجة يمكن أن يحقق :-
أ - True - to - type :-
النباتات المنتجة من نشاط القمم المرستيمية تكون من الناحية الوراثية مطابقة تماماً للنسيج الأم المأخوذة منه القمم المرستيمية مما يؤدي إلي المحافظة علي الصفات الوراثية - وإنتاج نباتات بهذه الكيفية إحدى مميزات التكاثر الخضري للمحافظة علي السلالات .
" Clone " سلالة :- هي النباتات الناتجة بدون تغير وراثي من فرد بمعني أنها سلالة من نبات واحد دون تغير في الصفات الوراثية أي أن جميع النباتات متشابهة وراثياً .
ب - Rapid :-
بمعني سريع … فترة كل خطوة من خطوات زراعة الأنسجة تتراوح من 4- 6 أسابيع فقط .
جـ - Mass production :-
بمعني إنتاج أعداد كبيرة في فترة قصيرة .
تبادل وحفظ التراكيب الوراثية ( الأنواع ) :-
Germplasm Storage and exchange
أ - يمكن خلال زراعة الأنسجة تبادل الأصناف الجديدة والقديمة بين الدول دون الخوف من انتشار الأمراض من الدول المصدرة إلي الدول المستوردة فمثلاً ظهور صنف جديد في منطقة أو دولة ما قد تقف إجراءات الحجر الزراعي والخوف من انتشار الأمراض عائقاً في سبيل نشر هذا الصنف ولكن عن طريق زراعة الأنسجة يمكن التغلب علي هذا العائق .
ب - حفظ التراكيب الوراثية يعتبر هدف عظيم بالنسبة لعلماء التربية حيث يمكنه حفظ أنواع معينة أو أصناف معينة في أنابيب تحفظ في ثلاجات لإيقاف نموها حتى يحتاج إليها في عمليات التربية والتهجين المختلفة وذلك بدلاً من زراعتها في الحقل مباشرةً والمحافظة عليها في الحقل الذي يتطلب كثيراً من الوقت والجهد فضلا عن إمكانية فقدها في أي لحظة بسبب الظروف البيئية والحيوية في الحقل .
إنتاج نباتات خالية من مسببات الأمراض خاصة الفيروسية منها :-
Production of pathogens [mainly virus] - free plants
من المعروف أن بعض النباتات التي يتم إكثارها خضرياً تكون عرضة للإصابة بالأمراض الفيروسية والتي تنتقل من خلال وسائل الإكثار ومن أهم الأمثلة :- البطاطس - الثوم - الفراولة - وغيرها . لذلك فمن خلال مزارع الأنسجة يتمم زراعة جزء صغير جداً 0.2 - 0.5 ملليمتر . هذا الجزء غالباً خالي من الفيروس حتى في النباتات المصابة بالفيروس لعدم احتوائه علي أوعية vesseless وبطئ حركة الفيروس في المنطقة النشطة . النباتات الناتجة من هذا الجزء هي نباتات خالية من مسببات الأمراض وبذلك يمكن توفير ملايين الدولارات التي تستخدم في استيراد شتلات من مناطق باردة حيث لا ينمو الفيروس .
إنتاج العديد من المركبات العضوية والأمصال :-
Pharmacology, Vaccines
كثير من النباتات الطبية والعطرية تنتج مواد عضوية ذات أهمية خاصة طبية وصناعية مثل :-
الداتورا - السكران - الدجيتالس - الريحان - النعناع .
يزرع أجزاء منها لإنتاج نسيج الكالوس CALLUS الذي نستخلص منه المادة الفعالة بدلاً من اللجوء إلي زراعة النبات .
مثال :- إنتاج الكاكاو معملياً
تستخدم مزارع الأنسجة في إنتاج العديد من الأمصال Vaccines بنفس الأسلوب .
مكونات معمل زراعة الأنسجة :-
يتكون معمل زراعة الأنسجة من 4 حجرات هي :-
1 - حجرة المطبخ Kitchen area :-
تتم في هذه الغرفة غسيل جميع الأدوات المستخدمة في هذه الأنسجة مثل الزجاجات , أطباق بتري , المخابير , الماصات وغيرها من الأدوات الزجاجية حيث تغسل بالماء ( ماء مقطر مرتين ) D.D.W فقط ولا يستخدم الصابون مطلقاً .
2 - حجرة الزراعة Cultivation Room :-
ويتم في هذه الغرفة زراعة الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء في البيئات .
3 - حجرة النمو Growth Room :-
يتم في هذه الحجرة نمو الأجزاء المزروعة في البيئات ويجب توفر الظروف التالية في هذه الحجرة :-
حرارة 25 ْ م
ضوء 16 ساعة ضوء فلورسنت أبيض وذلك لأنه يوجد به جميع أطوال موجات الضوء كما أنه لا يؤدي إلي ارتفاع درجة الحرارة .
4 - حجرة التفريد Mist Room :-
في هذه الحجرة يتم تفريد النباتات النامية من الزجاجات أو أطباق تيري في بيت موسى أو تربة معقمة تماماً تحت ظروف متحكم فيها .
وبعد ذلك تجرى له عملية أقلمة ثم ينقل إلي الصوبة أو إلي الأرض المستديمة مباشرةً .
وعملية التفريد هذه تكسب النباتات النامية القوة والتحمل للظروف الطبيعية كي تستطيع الاستمرار في الحياة عند نقلها إلي التربة .
طرق نقل النباتات المزروعة :-
1 - نضع الأصيص في صوبة حتي يصبح متأقلم ونعمل علي رش رزاز متقطع لمدة أسبوع
2 - ننكس إناء زجاجي علي الأصيص في اليوم الأول يكون الإناء محكم وبعد مرور 24 ساعة نرفع الغطاء فترة وجيزة ثم نعيد تنكيسه وهكذا وفي كل مرة نزود فترة رفع الغطاء حتى يتأقلم النبات .
الظواهر المصاحبة لعملية الأقلمة :-
نتيجة عملية الأقلمة تحدث العديد من التغيرات الكيميائية والفسيولوجية والمورفولوجية
أولاً التغيرات الكيميائية والفسيولوجية :-
1 - زيادة نسبة الماء المرتبط غير الحر .
2 - زيادة نسبة السكر المختزل وغير المختزل وقلة النشا .
تحول البروتينات إلي أحماض أمينية .
ثانياً التغيرات المورفولوجية :-
- زيادة الطبقة الشمعية علي الأوراق للحماية من البرودة .
القوام الجلدي للأوراق .
نقص الحجم , حجم الأوراق يقل .
زيادة نسبة المادة الجافة .
قلة نسبة الماء القابلة للتجمد نتيجة ارتفاع الضغط الأسموزي .
الأجزاء النباتية المستخدمة في زراعة الأنسجة Explants :-
تتنوع الأجزاء النباتية المستعملة في زراعة الأنسجة وذلك علي حسب :-
نوع النبات - هدف الدراسة .
فقد نستخدم :-
القمم النامية للبراعم - الجذور - أي جزء من الورقة - برعم جانبي - جزء من الحزم الوعائية للجذور - أو يتم استخدام المتك أو حبوب اللقاح المعزولة أو الأجنة المعزولة عقب التلقيح والإخصاب أو نستخدم البويضات أو المبيض كله وما يحمله من بويضات بعد إزالة أغلفة المبيض .
ويشترط في الجزء النباتي المستخدم :- قدرته علي الانقسام الميتوزي حيث يعتبر اختبار الجزء النباتي المستعمل وكذلك مرحلة نمو هذا الجزء ذات أهمية كبيرة في زراعة الأنسجة وفي جميع الأحوال يجب تعقيم الجزء النباتي المستخدم قبل البدء في زراعة الأنسجة ومن أبسط الطرق المستخدمة في التعقيم هي غمس النسيج في كحول لعدد قليل من الثواني ثم يعامل بمحلول كلوراكس 5 - 15 % لمدة 5 - 20 دقيقة .
طرق التعقيم في زراعة الأنسجة :-
تختلف طريقة التعقيم حسب الجزء المراد تعقيمه كالتالي :-
1 - يتم تعقيم المعمل كلياً بالفورمالين .
2 - يتم تعقيم الأدوات الزجاجية والمعدنية علي درجة حرارة 160 ْ م لمدة 4 ساعات في الاوتوكلاف .
أو في الفرن مباشرةً علي درجة 200 ْم لمدة 4 - 24 ساعة .
3 - يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْم وضغط 15 ضغط جوي لمدة 15 دقيقة .
ولا يمكن تعقيم البيئة في الفرن مباشرةً لعد وجود ضغط به حيث أن الضغط هو الذي يقوم بالتعقيم وقتل الميكروبات وليست الحرارة .
الهرمونات ومنظمات النمو يتم تعقيمها بواسطة المرشحات وهي لها أشكال وطرق مختلفة في التعقيم :-
فبعض منها عبارة عن إناء زجاج من أعلى ومن أسفل إناء آخر وبالمنتصف المرشح حيث يتم وضع الهرمونات أو منظمات النمو أعلى فيحدث لها ترشيح وفصل الميكروبات خلال المرشح ثم تتجمع في الإناء السفلي .
الأجزاء النباتية :-
يتم تعقيمها بالكلوراكس ( هيبو كلورات صوديوم ) 5 % لمدة 15-20 دقيقة .
أو بتركيز 10 % - 20 % لمدة 10 - 30 دقيقة . أو باستخدام الكحول 70 % لمدو 1 - 5 دقائق
أو باستخدام الكحول المطلق 90 % لمدة ثواني ثم الغسيل بالماء المقطر مرتين عدد 2 - 3 مرات .
البذور :- يتم تعقيمها بنترات الفضة أو محلول السليماني .
ملحوظة :-
يمكن استخدام المضادات الحيوية عندما يكون النبات مصاباً من الداخل كوسيلة للتعقيم ويكون النبات المصاب هام جداً فيستخدم المضادات الحيوية مثل الأبسيمين واسع المفعول ومدى استخدامه 50 - 150 ميكروجرام /مم3 .
مكونات البيئة الغذائية المستعملة في زراعة الانسجة :-
يجب أن تتوافر في البيئة الغذائية المستخدمة في زراعة الانسجة المكونات التالية:-
1 - مصدر طاقة :-
وهو عبارة عن أنواع السكريات المختلفة كالسكروز والجليكوز وتعتبر هذه السكريات مصدر الكربون أيضاً .
2 - مصدر الأملاح :-
مثل الكالسيوم والصوديوم والماغنسيوم وK وهي من العناصر الرئيسية في البيئة التي يتغذى عليها النبات النامي ونقص أي من العناصر قد يؤدي إلي ضعف النبات وقد يؤدي بحياته.
3 - مصدر الفيتامينات :-
مثل الثيامين Thiamin , وفيتامين B ,وحامض الأسكوربيك (فيتامينC) .
4 - الأحماض الأمينية :-
والمواد العضوية مثل الكازين المحلل أنزيمياً , الجلوتامين .
5- الهرومنات ( منظمات النمو ) :-
أ - أوكسينات :-
وهي هرمونات نباتية تسبب كبر وزيادة الخلايا في الحجم وتنشط تكوين الجذور وتتحكم في نمو وتكوين البراعم مثل أندول أسيتك آسيد 2.4D .
ب - سيتوكاينين :-
وهي هرمونات نباتية يختص بإنقسام الخلايا وزيادة نموها وتشكلها وتميزها مثل الكاينين وهي تشجع تكوين المجموع الخضري .
6- مركبات طبيعية :-
مثل كازين اللبن , لبن جوز الهند , مستخلص الخميرة .
7- الأجار :-
وتستخدم في حالة ما إذا كانت البيئة المطلوبة نصف صلبة .
8- يجب مراعاة ضبط الpH البيئة الغذائية في مدى 5.5 - 5.8 وهو أنسب التركيزات لاستفادة جميع الأجزاء النباتية من العناصر الغذائية الموجودة في البيئة وكذلك لإتمام جميع العمليات الفسيولوجية بنجاح .
أضرار الحرارة المرتفعة علي البيئة الغذائية :-
تختلف الكيماويات المستخدمة في البيئة الغذائية في تأثرها بدرجة الحرارة العالية .
حيث تؤثر درجة الحرارة تأثيراً كبيراً علي منظمات النمو كالتالي :-
الجبرلينات :-
يتكسر الجبرلين بنسبة 90 % في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْ م لمدة 15 دقيقة وتحت 15 ض . ج .
الأوكسينات :-
NAA , IAA , 2.4.D تتحمل الحرارة مع أن IAA لا يتأثر بالتعقيم في الأوتوكلاف تحت الظروف العادية إلا أنه خاضع للانحلال بالعوامل الأخرى مثل ال pH حيث أن تغير ال pH يسرع من تحلل IAA .
السيتوكيتينات :-
لا يتأثر المحلول المائي من الكاينين والزياثين والبنزيلأدينين بدرجات الحرارة العالية .
من ناحية أخرى فإن تعريض الصورة الغير نشطة من مادة Substituted purine ولدرجات الحرارة العالية أثناء تعقيمها في الأوتوكلاف فإنها تتحول إلي الصورة النشطة Nb Substituted purine تساعد في تكوين الكالوس .
لا تؤثر الحرارة العالية علي حامض الأبسيسك ولكن يؤثر عليه الضوء .
الثايمين Hcl عند غليانه علي درجة حرارة 110ْ م في محلول مائي يتكسر بسرعة عندما يصل ال PH إلي 5, 5 .
أنثوسيانات الكالسيوم لا يمكن تعقيمه بالحرارة العالية وذلك لسرعة تكسره بالحرارة .
السكروز الثنائي هو أكثر الكربوهيدرات استخداماً في البيئة يتحللب التعقيم في الأوتوكلاف ليعطي مخلوط من D جليكوز , D فركتوز . بالإضافة إلي ذلك فإن التعقيم الحراري قد يكون له تفاعلات وسيطة داخل البيئة بين الكربوهيدرات والأحماض الأمينية .
البيروكسين يتحلل بسرعة بالحرارة العالية .
تجهيز معمل زراعة الأنسجة :-
يجب توفير الأجهزة التالية في معمل زراعة الأنسجة :-
1 - جهاز تقطير الماء :-
الماء المستخدم في زراعة الأنسجة لابد أن يكون مقطر مرتين Double destile water ويمكن الحصول عليه من جهاز تقطير الماء مرتين وقوته 200.000 أوم / ساعة .
شروط الماء المستخدم في زراعة الأنسجة :-
1 - خالي من الشوائب حتى لا يحدث تلوث للبيئة .
2 - خالي من الأملاح المعدنية حتى لا يؤدي ذلك لتغير pH البيئة وبالتالي تصبح سامة للنبات .
3 - أن يكون الماء مقطر مرتين D.D.W .
وعن طريق جهاز وهو عبارة عن عمود من الراتنجات به شحنة موجبة وأخرى سالبة وذلك لجذب الأملاح الموجودة في الماء وبالتالي تقطيره أو عن طريق الأسموزية وهو عبارة عن غشاء يوضع بداخل أسطوانة يوجد بخارجها تركيز عالي وبداخلها تركيز منخفض فيتم بذلك الاتحاد مع الأملاح التي توجد بالماء وبالتالي تقطيره .
وتعد الطريقة الأولي أكثر الطرق استخداماً وأفضلها .
ملحوظة :-
يمكن استخدام ماء الأمطار في زراعة الأنسجة .
2 - الميزان :-
يجب توفير ميزان بمعمل زراعة الأنسجة وأن تكون حساسية الميزان
2 -5 مليجرام ويزن حتى 50 جرام أي حساسية الميزان حتي الرقم العشري الثالث .
3 - جهاز لضبط ال pH :- pH Meter :-
حيث انه لابد أن يكون pH البيئة المستخدمة يتراوح من 5.5 - 5.8 ويجب أن تكون حساسية الجهاز 1.4 P.P.m
ويستخدم لضبط pH البيئة محلول Hcl مخفف ( 1ع ) لخفض ال pH عندما يكون الوسط قلوي .
ويضاف KOH لرفع ال PH عندما يكون الوسط حامضي .
ملحوظة :-
تستخدم KOH بدلاً من NaOH حتى يستفيد النبات من عنصر البوتاسيوم كما أنه عنصر غير سام بالنسبة للنبات .
4 - جهاز سخان ومقلب :-
يستخدم السخان لتسيح أو لانصهار الآجار في حالة البيئات الصلبة حتى يسهل صبه ويستخدم المقلب في إذابة المحاليل وهو عبارة عن مغناطيس يمكن استخدامه أيضاً في تقليب الآجار حتى لا يلتصق ويأخذ اللون الأسود , وكذلك في إذابة المحاليل والكيماويات ويستخدم أيضاً في تقليل التلوث الموجود علي الأجزاء النباتية .
5- أجهزة تنظيف الأجزاء النباتية :-
تتم عملية تنظيف الأجزاء النباتية بإحدى الطرق التالية :-
أ - وضع الأجزاء النباتية في كأس وتغطيته بشاش أو سلك وفتح الصنبور عليه .
ب - عن طريق استخدام المقلب .
جـ - عن طريق إحداث موجات فوق صوتية تحدث ذبذبات شديدة الأجزاء النباتية وبالتالي تنظيفها .
د - عن طريق غمس الأجزاء النباتية في الكحول 95 % لمدة ثواني ثم وضعها في محلول كلوراكس 15 % لمدة 15 دقيقة وبعد ذلك توضع في ماء مقطر ثلاث مرات للتخلص من أثر الكلوراكس .
6- أجهزة صب البيئة :-
تستخدم هذه الأجهزة في صب البيئة في أطباق بتري أو الزجاجات التي يتم الزراعة فيها وتختلف هذه الأجهزة عن بعضها ويوجد منها عدة أشكال :-
أ - أحد هذه الأجهزة عبارة عن حقنة زجاجية كبيرة مدرجة تنتهي هذه الحقنة بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والأخرى لصبها في الأطباق وذلك علي حسب الحجم المطلوب .
ب - يوجد جهاز كهربائي لصب البيئة وهو ينتهي أيضاً بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والآخر لصبها في الأطباق ويتم التحكم في الحجم المطلوب وجوده ميكانيكياً .
7- أجهزة تعقيم البيئة :-
يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْ م وتحت ضغط جوي 15 ض. ج 15 Psi لمدة 15 دقيقة .
8- الهزاز الدائري :-
يستخدم الهزاز الدائري في الاستعمالات التالية :-
أ - الزراعة المائية مثل زراعة الجذور والأقراص الورقية .
ب - فصل الخلايا من الكالوس بوضعه في محلول مائي .
جـ - زراعة الخلايا علي الميكروفيلم في البيئة المائية .
يستخدم هذا الجهاز في حدود 100 R . B .Y
9 - آلة غسيل الأدوات :- Dishwasher :-
يتم فيها غسيل معظم الأدوات الزجاجية مثل أطباق يتري , الماصات , المخابير , الزجاجات , وغيرها من الأدوات الزجاجية المعدنية .
ويستعمل في الغسيل ماء مقطر مرتين ولا يستخدم الصابون مطلقاً .
10 - الثلاجة :-
وتستخدم الثلاجة في تخزين البيئات , الكيماويات , المحاليل المغذية , ويفضل وجود حجرة كاملة للتخزين .
11 - ميكروسكوب :- Microscope :-
وهو يستخدم في حالات نادرة مثل انصهار البروتوبلاست ويستخدم أيضاً لفحص الخلايا والأنسجة .
12 - الهود :- Transfer Hood :-
وهو المكان التي تتم فيه زراعة الأجزاء النباتية ويجب أن يكون معقم 100% .
13 - الأرفف :- Shelves :-
يستخدم الأرفف في وضع الأدوات عليها مثل الأدوات الزجاجية والمعدنية .
14 - فرن :-
وذلك لتجفيف الأوعية والزجاجات وتعقيمها علي درجة 200 ْ م
لمدة 4 -24 ساعة .
15 - الأدوات الزجاجية والمعدنية :-
دوارق مخروطية بأحجام مختلفة
دوارق معيارية بأحجام مختلفة
مخابير مدرجة بأحجام مختلفة
ماصات مدرجة بأحجام مختلفة
أطباق بتري , وزجاجات بأحجام مختلفة للزراعة فيها .
ملاقط كبيرة ذات أطراف غير حادة للزراعة .
ملاقط ذات أطراف حادة لنزع بشرة الأوراق .
ابر تشريح .
ما هي الإرشادات الهامة التي يجب مراعاتها في معمل زراعة الأنسجة :-
هناك بعض الأمور الهامة التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند المعمل في مجال زراعة الأنسجة :-
1 - يجب عدم تقريب الكحول من اللهب لأنه سريع الاشتعال .
2 - يجب عدم استنشاق هيبوكلوريد الصوديوم لأنه سام جداً .
3 - يحظر عدم إطالة النظر إلي لمبة Ultraviolet لأنها تسبب العمى .
4 - الاحتراس عند التعقيم بمحلول السليماني لأنه شديد السمية .
يجب الاحتراس عند استعمال الكيماويات لأنها شديدة السمية .
ينصح بغسيل الأسطح غسيلاً جيداً بالكحول 70 % أكثر من مرة وذلك لتقليل التلوث .
بنصح بأن تكون الملابس التي يرتديها من يقوم بالزراعة نظيفة لتقليل التلوث .
يجب تعقيم المعمل كله تعقيماً جيداً لضمان خلوه من الميكمروبات قبل بدء العمل .
تعقيم الأدوات المعدنية بالكحول وتعريضها للهب حتى الاحمرار لتقليل أي ميكروبات توجد عليها .
تعقيم الهود جيداً قبل الزراعة .
أن يكون الماء المستعمل في زراعة الأنسجة مقطر مرتين ومعقم حتى نضمن خلوه من الميكروبات والأملاح .
تعقيم الأيدي باستمرار أثناء الزراعة لضمان التعقيم التام .
ينصح باختبار الهود قبل الزراعة فيه للتأكد من خلوه من التلوث .
التأكد من التعقيم التام لأدوات الزراعة والبيئات والأجزاء النباتية المستخدمة في الزراعة لضمان نجاح العمل .
بنصح بعدم التحدث أثناء الزراعة تجنباً للتلوث .
ينصح بعد إمرار الأيدي فوق مكان الزراعة تجنباً للتلوث .
كيفية اختبار التلوث الموجود في الهود :-
لمعرفة مدى نظافة الهود وملاءمته للزراعة به نضع بداخله عدد من أطباق تيري بكل منها بيئة مغذية وتوزع الأطباق في أماكن مختلفة من الهود ونتركها لفترة معينة ثم نكشف عنها لمعرفة وتقدير مدي تلوث البيئات بكل طريق .
ظاهرة Habituation :-
هي تأثير مباشر لنمو الأجزاء النباتية المزروعة علي بيئة غذائية بها أحد الهرمونات ( مثل السيتوكاينينات ) حيث يحدث له تشبع وعند نقله هإلي بيئة جديدة ليس بها هذا الهرمون فإنه بنمو نمواً جيداً كما لو كان بالبيئة هذا الهرمون وتسمى هذه الظاهرة بظاهرة التعدد .وتسلك الأجزاء النباتية هذا السلوك في مرة واحدة فقط أما لو نقلت إلي بيئة أخرى مرة ثانية وكانت هذه البيئة خالية من الهرمون فإنها لا تسلك نفس السلوك السابق .
مثال :-
عند تنمية القطع الساقية للبطاطس في بيئة بها بنزيل آدينين يتكون بها جذور وعند تنمية الجذور في بيئة سائلة خالية من البنزيل آدينين فإن المناطق التي يحدث بها جرح تكون كالوس علي الجذور وتسمى هذه
مجالات زراعة الأنسجة
مزارع الخلايا Cell culture :-
تعتبر أول خطوة في عمل مزارع الخلايا هي عزل الخلايا المفردة وتتم عملية عزل الخلايا المفردة إما بالوسيلة الميكانيكية وإما أنزيمياً من الأعضاء النباتية وإما تؤخذ من نسيج كالوس نامي .
يلي هذه الخطوة زراعة الخلايا المفردة علي البيئة المناسبة , وتعد طريقة برجمان من اكثر الطرق شيوعاً في زراعة الخلايا المفردة ويراعي في هذه الطريقة أن يكون تركيز الخلايا المفردة في البيئة السائلة ضعف التركيز النهائي المطلوب عند الزراعة .
وتتوقف طبيعة النمو في مزارع الخلايا علي تركيز الهرمونات في بيئة النمو حيث انه قد يكون النمو متميز أي يتكون نموات خضرية أو جذرية أو كليهما أو قد يكون النمو غير متميز أي تتكون كتلة من الخلايا تسمي كالوس Callus .
وينتج الكالوس من أي نسيج نباتي متميز . بوضع الجزء النباتي الذي تؤخذ منه الخلايا في بيئة تحتوي علي تركيز مرتفع من الأوكسين وتركيز منخفض من السيتوكينين حيث يتكون الكالوس عند ذلك ويمكن أن يستمر في النمو إما علي صورة كتل متعددة الخلايا في البيئات الصلبة أو علي أشكال تجمعات صغيرة من الخلايا في البيئات السائلة .
ومع استعمال تركيز مرتفع من السيتوكينين ومنخفض من الأوكسين فأنه يمكن أن تتكون الجذور والسيقان والأوراق .
تكوين الأجنة الجسمية في مزارع الخلايا:-
يجب توفر شروط معينة لتكوين الأجنة الجسمية في مزارع الخلايا وهذه الشروط تتعلق بمنظمات النمو وخاصة السيتوكينينات , والأوكسينيات , ومصدر النيتروجين فمثلاً في مزارع الجذور تتكون الكالوس عندما تكون البيئة في الأوكسين وعند نقل هذه الخلايا إلي بيئة ذات تركيز منخفض أو خالية من الأوكسين فأنه تتميز الأجنة الكاملة .
أما مصدر النيتروجين في البيئة فيكون في صورة مختزلة مثل كلوريد أمونيوم أو نترات بوتاسيوم .وتكوين الأجنة يتطلب حد أدني من أيون الأمونيا داخل الخلايا ويتحقق ذلك بوجود تركيز منخفض من الامونيا أو تركيز مرتفع من النترات في البيئة ويجب توفير تركيز عالي من البوتاسيوم وألا يزيد الأكسجين الذائب عن 1.5مليجرام /لتر لأن التركيز العالي يشجع تكوين الجذور.
أهمية مزارع الخلايا أو الأنسجة في تربية النبات :-
يمكن الاستفادة من مزارع الأنسجة أو الخلايا في تربية النبات كالتالي :-
يمكن الحصول علي الاختلافات الوراثية التي يحتاج إليها المربي في برامج التربية من مزارع الأنسجة فمثلاً:-
-تعتبر مزارع الخلايا مصدراً هاماً للطفرات التي تعتبر أحد مصادر التصنيفات الوراثية وذلك لأن كل خلية لها القدرة علي أن تصبح فرد جديد وبالتالي احتمالات الحصول علي طفرات يكون كبير .
ولقد لوحظت هذه الطفرات في مزارع محاصيل الخس,الثوم,الأرز,غيرها.
2-يمكن عن طريق مزارع الأنسجة انتخاب نباتات مقاومة للأمراض والظروف البيئية الغير مناسبة فمثلاً:-
-أمكن انتخاب صنف طماطم يتحمل تركيزات مرتفعة من الملوحة كذلك أمكن انتخاب سلالات خلايا مقاومة للملوحة من مزارع الخلايا لعدة محاصيل مثل الفلفل , البرتقال , الأرز , القلقاس .
-كذلك أمكن إنتاج سلالات مقاومة للفيروس من نبات الدخان من مزارع الخلايا .
مزارع المتوك Anther culture
تفيد مزارع المتوك في إنتاج نباتات أحادية Haploid من حبوب اللقاح إما من خلال تكوين أجنة أو من خلال تكوين الكالوس .
ما يراعى عند عمل مزارع المتوك :-
1 - يجب أن تؤخذ المتوك من نباتات حديثة الإزهار ويكون ذلك في مرحلة معينة من تكوين حبوب اللقاح قبل تفتح الزهرة .
لذلك يفضل زراعة النباتات التي تؤخذ منها المتوك في ظروف متحكم فيها بيئياً ليمكن الربط بين المظهر الخارجي للبرعم الزهري والمرحلة المناسبة لتكوين حبوب اللقاح .
2 - يجب تطهير البراعم الزهرية المنتخبة بأحد المطهرات المناسبة ثم تفصل الأسدية كاملة ( متك + خيط ) وتوضع في طبق بتري معقم .
3 - يجب ان تسحق أحد المتوك في صبغة أسيتوكارمن لإختبار مرحلة تكوينه فإذا كانت المرحلة مناسبة تفصل بقية المتوك عن الخيوط وتوضع أفقياً في بيئات زراعية .
4 - يجب الحذر والحرص عند فصل وزراعة المتوك حتى لا تحدث أضراراً لها حيث أن تجريحها يؤدي إلي تحفيز تكوين كالوس من خلال جدر المتوك وهي خلايا ثنائية .
5- يجب تحصين مزارع المتوك من الضوء لمدة 12 - 18 ساعة وعلي درجة حرارة 28 ْ م بالتبادل مع فترة ظلام مدتها 6 - 12 ساعة علي درجة حرارة 22 ْ م , بعد 3 - 8 أسابيع يبدأ تفتح المتوك وتحولها إلي اللون البني وذلك بسبب ضغط الكالوس المتكون من حبوب اللقاح علي المتوك أو بسبب النباتات الصغيرة التي تنمو فيها .
6- تفصل النباتات المفردة أو النموات الخضرية المتكونة من الكالوس بعد أن يصل 3 - 5 سم وتنقل إلي بيئة مناسبة لتكوين الجذور ثم بعد ذلك تنقل النباتات التي تكونت جذورها إلي أصص صغيرة معقمة .
أهمية مزارع المتوك وحبوب اللقاح :-
1 - ترجع أهمية هذه المزارع إلي الحصول علي نباتات أحادية المجموعة الكروموسومية إما من خلال تكوين الأجنة أو تكوين الكالوس ويفيد ذلك في الآتي :-
أ - تستخدم النباتات الأحادية في الحصول علي نباتات ثنائية أصيلة من المحاصيل الخلطية التلقيح وذلك بمعاملتها بالكوليثيشين .
وذلك يوفر من 6 - 8 أجيال للتربية الذاتية .
ب - تفيد النباتات الأحادية في الحصول علي مختلف حالات التعدد الكروموسومي الغير تام .
2 - تفيد مزارع المتوك في التعرف علي الطفرات المنتخبة بسهولة .
3 - استخدمت وزارع المتوك في إنتاج أصناف محسنة لبعض المحاصيل في وقت قياسي مثل القمح - الأرز - الشعير .
4 - إنتاج أصناف هجين من الهليون جميع نباتاتها مذكرة .
مزارع الأندوسبرم Endosperm culture :-
تفيد مزارع الأندوسبرم في إنتاج نباتات ثلاثية المجموعة الكروموسومية حيث أن الأندوسبرم نسيج ثلاثي 3n ينتج من اندماج إحدى الخليتين التناسليتين لحبة اللقاح مع نواتا الكيس الجنيني . ويتم الحصول علي النباتات الثلاثية عن طريق تكوين براعم من الأندوسبرم مباشرةُ أو عن طريق الكالوس . ويجب ملاحظة أن الأندوسبرم الكامل النمو لا يصلح للزراعة لذلك يجب مراعاة عزل الأندوسبرم بعد مدة معينة من التلقيح وهي تختلف من نوع إلي لآخر فمثلاً في الذرة 8 - 11 يوم وفي الأرز من 4 - 7 يوم . ومن النباتات التي تنجح فيها زراعة الأندوسبرم البقدونس - الأرز - الكمثرى .
التلقيح في مزارع المبايض والبويضات :-
يستخدم مصطلح in vitro pollination في جميع الحالات التي توضع فيها حبوب اللقاح مباشرة علي البويضات المفصولة في بيئة صناعية أو علي مياسم الأزهار التي فصلت ووضعت في بيئة صناعية أو علي البويضات التي فصلت من مشيمتها في بيئة صناعية .
تعريف مزارع البويضات :-
هي المزارع التي يتم فيها زراعة البويضات منفصلة أو نزع البويضات من المشيمة في بيئة صناعية Ovule culture .
مزارع المبايض :-
هي الخالة التي يتم فيها زراعة المياسم الأزهار في بيئة صناعية Ovule culture .
يتم خص الأمهات قبل تفتح الأزهار بيومين ثم تكيس وتجمع الأزهار المخصية بعد تفتحها بيوم أو اثنين حيث يزال الكأس والتويج ويغمس المتاع في كحول 70 % لمدة ثواني ثم يغسل جيداً بالماء المقطر ثم يزال الميسم والقلم وجدار المبيض وبذلك تبقي المشيمة والبويضات وقد تزرع البويضات الاثنتان معاً في حالة مزارع المبايض يزرع الميسم كاملاً .
يتم جمع متوك غير متفتحة من الآباء وتحفظ في طبق تيري معقم إلي أن تتفتح حيث تنقل حبوب اللقاح بحرص وتوضع علي البويضات المزروعة او علي المياسم أو المشيمة .
ويكون الهدف من هذه المزارع الحصول علي بذور مكتملة التكوين ونجحت هذه الطريقة مع الطماطم - الفاصوليا - الشليك .
أهمية مزارع المبايض والبويضات :-
1 - إنتاج نباتات أحادية من خلال التوالد الذاتي .
2 - يتم التغلب علي حالات عدم التوافق الذاتي والخلطي في مزارع البويضات حيث يتم إزالة أنسجة المبيض الأمية المسؤلة عن عدم التوافق .
3 - التغلب علي مشاكل العقم في بعض الهجن النوعية البعيدة .
4 - الحصول علي بذور مكتملة التكوين .
مزارع الأجنة :- Embryo cultures :-
تفيد مزارع الأجنة في التغلب علي مشاكل الإخصاب في التلقيحات البعيدة ويتحكم في نجاح مزارع الأجنة عاملان هما :-
1 - عملية فصل الأجنة الصغيرة
2 - تحديد بيئة الزراعة المناسبة
كما يجب فصل الأجنة قبل أن تبدأ في التدهور والاختفاء كما في حالات الهجن النوعية البعيدة التي يحدث بها عدم توافق بين الجنين النامي والأندوسبيرم , وتحدد مرحلة فصل الجنين المناسبة بعدة أيام من التلقيح .
ونظراً لأن الأجنة تكون محاطة بأنسجة المبيض لذا فإنها لا تكون عرضة للتلوث ولا تحتاج إلي تعقيم ويكتفي بتطهيرها سطحياً .
وعملية فصل الأجنة تحتاج إلي مجهر حتى تتم عملية الفصل بدقة .
ثم تزرع هذه الأنسجة في البيئة المناسبة حتى يكتمل نموها بعد الزراعة ثم تنمو بعد ذلك إلي نباتات صغيرة تنقل بعناية إلي أصص معقمة .
ولقد أمكن زراعة أجنة بعض الهجن النوعية للجنس Brassica حيث تم حصاد مبايض الأزهار الملقحة في الوقت المناسب وتعقم ثم بعد ذلك تقطع طولياً ثم تنقل إلي بيئة مغذية علي جهاز هزاز حيث أدت الحركة الدائمة للبيئة المغذية إلي خروج عدد من الأجنة من مبايض الأزهار .
أهمية مزارع الأجنة :-
1 - إمكانية الحصول علي الهجن البعيدة التي يستحيل الحصول عليها أو إنتاجها بالطرق العادية مثل هجن أجناس الفاصوليا , الكرنب , الطماطم .
2 - إنتاج النباتات الأحادية بسبب الاستبعاد الكروموسومى الذي يحدث أحياناً بعد التهجينات البعيدة , ثم يقوم المربي بمضاعفة الكولوشيسين فيتجمع لديه عدد كبير من النباتات الأصلية المختلفة وراثياً وبالتالي يمكن الانتخاب لأفضلها ليصبح صنف جديد .
3 - تقصير دورة التربية وذلك بالتخلص من حالات سكون البذرة التي قد تمدد إلي شهور .
4 - إكثار بعض النباتات التي لا تنبت بذورها .
مزارع البروتوبلاست :- Protoplast culture :-
تعرف مزارع البروتوبلاست علي انها زراعة الخلايا بدون جدرها الخلوية.
تفيد مزارع البروتوبلازم في عملية دمج البروتوبلازم Protoplasm fusion عند الرغبة في إجراء تهجينات نوعية بعيدة وكذلك عملية إدخال أجزاء غريبة من DNA أو بكتريا أو فيروسات معينة في الهندسة الوراثية حيث يتم عزل البروتوبلازم عن الجدر الخلوية ويزرع في بيئة مناسبة ويتم هذا بواسطة أنزيم السليوليز الذي يحفز من مزارع الفطر .
تعد الأوراق الحديثة التكوين أفضل مصادر الخلايا لمزارع البروتوبلازم حيث يطهر النسيج النباتي المستعمل سطحياً ثم تسلخ بشرة الورقة أو يقطع الجزء النباتي إلي أجزاء صغيرة ويوضع في محلول الأنزيمات ويفضل أن تكون المعاملة بالأنزيمات الهاضمة تحت تفريغ لإسراع عملية تخلل الأنزيمات بين الخلايا وتستمر المعاملة بالأنزيمات 1/2 ساعة إلي ساعة . ثم تزرع علي البيئة الملائمة ويفضل أن تكون سائلة وتظهر الجدر السيليوزية حول البروتوبلازت بعد 2 - 14 يوم . ونجحت هذه الطريقة في العائلة الباذنجانية كالفلفل - الباذنجان - البطاطس .
أهمية مزارع البروتوبلازم :-
1 - يمكن الاستفادة منها في الإكثار وعزل السلالات الفطرية .
2 - دمج بروتوبلازم الأنواع النباتية البعيدة عن بعضها وهوو يعد وسيلة فعالة لإجراء التهجينات البعيدة .
3 - إدخال صفة العقم الذكري السيتوبلازمي في النباتات .
4 - الحصول علي نباتات وراثية يمكن الاستفادة منها في تحسين النباتات وخاصاً العقيمة منها .
5 - إدخال أجزاء من DNA أو البكتريا أو الفيروسات في الهندسة الوراثية .
تعريف البروتوبلاست :-
هو عبارة عن خلايا منزوعة الجدر السليوزية إما عن طريق الأنزيمات ( Cellulase ) أو بطرق أخرى .
مزارع القمة الخضرية المرستيمية :-
يستفاد منها في إنتاج نباتات خالية من الفيرس ويعد ذلك أمر بالغ الأهمية في المحاصيل خضرية التكاثر والتي ينتقل فيها الفيروس تلقائياً مع الأجزاء الخضرية المستخدمة في التكاثر .
وبالرغم من أن النباتات قد تكون مصابة جهازياً بالفيروس إلا أن القمة المرستيمية تكون خالية غالباً أو تحتوي علي عدد قليل جداً من الفيروسات وذلك للأسباب التالية :-
1 - خلو القمة المرستيمية من الأنسجة الوعائية التي يكون انتقال الفيرس فيها سريع .
2 - يكون النشاط الأيضي في القمة المرستيمية غالباً بدرجة يقل معها تكاثر الفيرس .
3 - نظم المقاومة لتكاثر الفيرس تكون أعلي في الأنسجة المرستيمية عنن أي نسيج آخر .
4 - التركيز العالي للأوكسين في القمم النامية يثبط نشاط الفيرس .
ولهذه الأسباب فإن زراعة القمم المرستيمية تؤدي إلي إنتاج نباتات خالية من الفيرس .
ويكون طول القمة المرستيمية 250 ميكرون وعرضها 100 ميكرون ولصعوبة فصل هذه القمة فإنه تستعمل القمة النامية كلها .
ويطلق علي المزارع في هذه الحالة shoot Tip Culture
وتعطي هذه المزارع أيضاً نباتات خالية من الفيرس في أغلب الأحيان .
والذي يحدد مستويات النجاح في هذه العملية هي الدقة في فصل القمة النامية بدون الأضرار بها وكذلك في اختيار البيئة المناسبة للزراعة التي يجب أن تكون محفزة لتكوين الجذور والأوراق من القمم المزروعة .
ملحوظة :-
البيئة الصلبة تشجع تكوين الكالوس وهو أمر غير مرغوب في هذه المزارع ويجب ملاحظة أنه كلما زاد حجم القمة المرستيمية كلما زادت فرصة تمييز نباتات منها أما القمة المرستيمية الصغيرة فإنها تنتهي بتكوين بذور وكالوس فقط وقد لا تتكون جذور .
وعلي ذلك فالقاعدة العامة هي أن تكون القمم المرستيمية صغيرة بحيث تكون نباتات خالية من الفيروس وكبيرة بحيث تسمح بإعطاء نباتات كاملة
من ضمن فوائد زراعة القمة النامية ( القمة الخضرية ) Apical . M . T . C
الإكثار الخضري السريع للنباتات الممتازة لإجراء التجارب عليها أو بيعها في الأسواق .
مزارع الإكثار الدقيق :-
يستفاد من مزارع الإكثار الدقيق في إنتاج سلالات خضرية تحتوي علي عشرات الآلاف من النباتات الصغيرة خلال فترة وجيزة .
ويفضل دائماً استخدام القمة المرستيمية لأنها تكون خالية من الفيرس كما يجب استخدام أجزاء صغيرة من ساق النبات تحتوي كل منها علي عقد وبرعم جانبي وذلك كلأن البراعم الجانبية المفصولة من الأشجار لا تنمو بمفردها لذلك فإن النسيج الأمي الموجود معه يساعده علي النمو . كما أن البراعم الجانبية تتحمل التعقيم عن البراعم الطرفية .
ويحدث الإكثار الدقيق في المزارع بواحدة من ثلاث طرق :-
1 - من خلال الكالس :-
متعد هذه الطريقة من أسرع طرق الإكثار الدقيق إلا أن هذه الطريقة غير مفضلة للأسباب التالية :-
أ - لأن الكالس غير ثابت وراثياً حيث تظهر به حالات مختلفة من التضاعف الكروموسومي .
ب - لم يتميز الكالس إلي نموات نباتية في العديد من المحاصيل الهامة .
2 - من خلال تكوين البراعم العرضية :-
يقصد بالبراعم العرضية تلك البراعم التي تتكون مباشرة من العضو النباتي دون أن يفصل بينها نسيج كالوس .
وتتكاثر أعداد كبيرة من المحاصيل الاقتصادية بهذه الطريقة .
3 - من خلال تحفيز التفرع الجانبي :-
يتم تحفيز التفرع الجانبي في المزارع بتوفير السيتوكينين بها بتركيز معين إما مع الأكسين أو بدونه حيث يؤدي توافر السيتوكينين بالمزرعة إلي نمو البراعم الجانبية التي تكون في القمم المرستيمية التي تنمو من البراعم المزروعة ثم تنمو البراعم الجانبية التي تكون في القمم المرستيمية الجديدة وهكذا . ويؤدي استمرار هذه العملية لعدة مرات إلي تكوين كتلة من النموات الجديدة .
ثم يلي ذلك نقل هذه النموات إلي بيئة أخرى تختلف في مكوناتها الهرمونية حتى تتم عملية التجذير وبع تكوين الجذور تنقل هذه النباتات إلي أصص معقمة بحرص تام ويجب رعايتها تماماً حتي يتم نقلها إلي البيوت المحمية .
بعض التعريفات الهامة في مجال زراعة الأنسجة
1 - زراعة المتوك ( حبوب اللقاح ) والبويضات :-Pollen, Anther and ovule culture
الهدف منها الحصول علي نباتات أحادية المجموعة الكروموسومية يطلق عليها Haploid وهذه النباتات تفيد في المجالات التالية :-
1 - الحصول علي نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية نقية وثابتة وراثياً وذلك بمضاعفة النباتات ال Haploid باستخدام الكوليثيسن وهذا يوفر الوقت والجهد ( 12 عام علي الأقل ) المبذول في الطرق العادية .
2 - استعادة بعض النباتات الهجين التي بها نسبة من العقم الذكري لخصوبتها ( كما في بعض نباتات الأرز )
3 - تستخدم مزارع المتوك في إنتاج أصناف هجين من الهليون جميع نباتاتها مذكرة فقط .
4 - انتخاب الطفرات المنتخبة والتي تغطى بالجين السائد في النباتات الخلطية .
5 - يمكن عمل الخريطة الكروموسومية مباشرةً حيث يمثل النبات الأحادي جاميطة واحدة .
6 - إنتاج نباتات لها سيتوبلازم خاص وذلك بزراعة النباتات التي تحتوي علي سيتوبلازم .
2 - نباتات أحادية المجموعة الصبغية :- Haploid plants
تتميز بأنها ( 1n ) أي بها نصف العدد الكروموسومي ويتم الحصول عليها من زراعة المتوك أو حبوب اللقاح .
وتفيد هذه النباتات في مجال تربية النباتات حيث عن طريقها :-
1 - يتم الحصول علي نباتات خالية من الأمراض وخاصة الفيروسية .
2 - يتم الحصول علي نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية نقية وثابتة وراثياً .
3 - معلق الخلايا :- Cell suspension
وهو عبارة عن زراعة الخلايا المراد إجراء تجارب عليها في بيئة سائلة مما يسهل زراعة هذه الخلايا أو حقنها داخل أي كائن حي .
4 - Batch culture
يقصد به زراعة بعض الأجزاء النباتية في حجم ثابت في بيئة الزراعة .
5 - زراعة الكالوس :- Callus culture
الكالوس :- هو عبارة عن تجمع بروتوبلازمي من خلايا غير مميزة أو غير مشكلة ( أي توجد جذور وسيقان وأوراق ) ] غير منتظمة [ .
فوائد استخدام زراعة الكالوس :-
أ - يعتبر الكالوس مصدر للاختلافات الوراثية الكروموسومية التي تزيد بزيادة عمر مزرعة الكالوس .
ب - انتخاب نباتات مقاومة للملوحة بتعريض الكالوس إلي المؤثرات المختلفة .
جـ - الحصول علي نباتات خالية من الفيرس .
د - استخلاص بعض المواد الخاصة بصناعة الأدوية أو الصناعات الغذائية كمستخلص نبات الفلفل الأخضر .
هـ - يستخدم في الإكثار الخضري السريع للنباتات المنتخبة حيث أن زراعة الكالوس يعطي عدد كبير من النباتات في وقت قصير .
ما يراعي عند إنتاج الكالوس :-
1 - مراعاة الدقة عند استخدام الجزء النباتي المستخدم .
2 - توفير البيئة المناسبة والظروف البيئية المناسبة لزراعة الكالوس .
3 - مراعاة الدقة في عزل والمحافظة علي الكالوس للتجارب الأخرى .
6- زراعة الخلايا :- Cell culture :-
هي عبارة عن زراعة الخلية في معلق الخلايا علي بيئة مناسبة في طبق بتري وتنمية هذه الخلية .
7 - إنصهار أو إندماج البروتوبلاست :- Protoplast fusion
وذلك يفيد في إنتاج هجين من خلال التهجينات بين الأنواع النباتية البعيدة وراثياً أي لا يتم بينها تلقيح وإخصاب في الطبيعة ويسمي الهجين الناتج ( Vegetative hybrids ) , ( Somatic hybrids ) , ( Cybrides ) ويتم ذلك بنزع الجدر السليلوزية .
8 - نقل الجينات :- Gene Transf
عبارة عن نقل جين حامل لصفة معينة في السلسلة الكروموسومية إلي نبات آخر ممتاز في صفاته ولكن ينقصه هذه الصفة ويتم ذلك من خلال الهندسة الوراثية حيث يتم نقل جين من كائن حي إلي كائن حي آخر وتعتبر هذه العملية سلاح ذو حدين .
9 - Somaclonal variation
يقصد به الاختلافات الموجودة ببعض النباتات النامية من خلايا جسمية علي بيئات زراعة الأنسجة .
10 - زراعة الأجنة :- Embryo culture
زراعة الأجنة تفيد في الحالات التي يفشل فيها الجين في الإنبات والنمو وتتم زراعتها علي بيئات مناسبة غذائية لاستكمال نموه وإعطاء نباتات كاملة وحدث ذلك في بعض أصناف الطماطم .
11 - تخليق الأجنة :- Embryo genesis
تفيد في الحالات التي يفشل فيها الإنبات نتيجة عدم تكوين الإندوسبيرم أو الأوراق الفلقية المحتوية علي الغذاء اللازم لنمو الجين .
مثل الهجين الناتج من نبات الراي والشعير حيث وجد أن أجنة هذا الجين لا تستطيع الإنبات والنمو وتم زراعتها علي بيئات غذائية مناسبة وأمكن الحصول منها علي نباتات كاملة .
12 - تخليق الأعضاء النباتية :- Organo genesis
يقصد بها الحصول علي نباتات كاملة مميزة من زراعة خلية أو أي نسيج نباتي آخر , وتفيد في حالة إكثار النباتات التي لا تنتج بذور . وذلك من خلال تنمية أحد الخلايا علي بيئة غذائية مناسبة تحتوي علي التركيز المناسب من الأوكسين والسبتوكاينين بحيث يسمح هذا التركيز بنمو أو تكوين كلاً من المجموع الجذري والمجموع الخضري حيث أن :-
زيادة تركيز السبتوكاينين في البيئة تؤدي إلي تكوين مجموع خضري فقط .
زيادة تركيز الأوكسين في البيئة تؤدي إلي تكوين مجموع جذري فقط .
الخلايا التي لها القدرة علي إعطاء جذور وسييقان تتميز بالآتي :-
1 - السيتوبلازم بها مركز .
2 - كبر حجم حبيبات النشا .
3 - الخلايا بها نواة كبيرة الحجم عن النواة الموجودة في الخلية العادية .
13 - الإخصاب في أنابيب :- in vitro pollination
للتغلب علي مشاكل الإخصاب المتعلقة بوجود عائق في المبسم بوضع البويضات مع حبوب اللقاح .
14 - الحصول علي نباتات خالية من الأمراض :- Apical culture to obtained diseases free plants
الحصول علي نباتات خالية من الفيروسات والأمراض من الأشياء الهامة عند تقييم النباتات قبل عمل التهجينات لمعرفة صفاتها التي قد تختفي نتيجة الإصابة للفيرس أو الأمراض .

وفي دراسة اكثار نبات الحنظل نسيجيا من اعداد الفريق البحثي: أمينة المالكي??? مريم الجتال??? سلوى الكواري??? د??? حمد آل سعد??? د??? الفاتح محمد مهدي??? مختبر زراعة الانسجة النباتية اوضح الباحثون انه رغم صغر المساحة التي تشغلها شبه الجزيرة القطرية الا ان الانواع النباتية البرية التي تنمو فيها يصل عددها الى اكثر من 300 نوع وتعتبر النباتات الطبية والعطرية المنتمية الى الفلورا القطرية احد اهم كنوز هذه الارض التي يجب علينا الاهتمام بها لفوائدها الطبية والاقتصادية والبيئية??? بدأ مختبر زراعة الانسجة النباتية بتوجيه الباحثين فيه لدراسة النباتات البرية ومحاولة اكثارها نسيجيا ويهدف هذا البحث الى دراسة واكثار احد اهم النباتات في البيئة القطرية وهو نبات الحنظل ويتطلب تحقيق الهدف الرئيسي لهذا البحث العمل على 4 مراحل هي: دراسة طبيعة نبات الحنظل وبيئته واهميته الاقتصادية??? تحديد المعاملة المثلى لانشاء زراعات معقمة خالية من التلوث الميكروبي واختبار استجابة انسجة مختلفة من نبات الحنظل للاكثار النسيجي وتحديد اسلوب الاكثار النسيجي الامثل لبنات الحنظل وذلك باختبار اوساط غذائية ومنظومات هرمونية مختلفة ومن هذا المنطلق فقد حثت وزارة الشؤون البلدية والزراعة الباحثين فيها على البحث وتجميع المعلومات وذلك لحصر النباتات الموجودة في بيئتنا القطرية وكتابة التقارير المفصلة عنها للحفاظ على انواع النباتات الموجودة واثبات انتمائها لهذه الارض ولكي تستخدم ايضا هذه الابحاث كمرجع لكل من هذه النباتات???
وما تزال خواص معظم النباتات البرية مجهولة حيث ان الانسان لا يستعمل منها لحاجياته سوى اليسير ومما لا شك فيه ان دراسة خواص النباتات المختلفة وتمييزها عن بعضها ومعرفة اسمائها الحقيقية ذا اهمية كبيرة وقد زاد هذا الاتجاه بشكل واضح في السنوات القليلة الماضية لعدة اسباب منها ان المواد المخلقة معمليا لا تعطي في كثير من الاحيان نفس التأثير الفسيولوجي الذي تعطيه المواد المستخلصة من النباتات قد يعود السبب في ذلك الى تأثير العوامل البيئية التي ينمو فيها النبات والتي تحثه على انتاج هذه المواد بينما يتم تخليق هذه المواد معمليا تحت ظروف مختلفة عن الظروف الطبيعية كما انه في كثير من الاحيان تكون للمواد المخلقة معمليا تأثيرات جانبية ضارة وقد لا تكتشف هذه الآثار الضارة الا بعد فترة كبيرة من استعمال الدواء???
وقد جاء ان النبات الواحد يحوي اكثر من مادة فعالة تعمل مع بعضها في صيغة من التكامل والتوازن لعلاج المرض وهذه الميزة لا تتوافر في العقاقير المصنعة معمليا اضافة الى ان بعض المركبات الطبيعية لم يتمكن العلم الحديث من تركيب مشابه لها معمليا رغم اهميتها مثل الهيوسيامين من نبات السكران والهيوسين من نبات الداتورا والخلين من نبات الخلة???
يهدف هذا البحث الى دراسة واكثار احد اهم النباتات في البيئة القطرية نبات الحنظل CITRULLUS COLOCYNTHIS L???SCHARD (CITRULLUS COLOCYTHIS - BITTER APPLE) المنتمي الى العائلة القرعية CUCURBITACEAE ورتبة القرعيات CUCURBITALSE وهو من ذوات الفلقتين ويعرف في اللغة العربية بالحنظل او العلقم??? وهو نبات حولي صيفي صحراوي ويعمر اذا لم تصادفه موجات برد شديدة كما انه من النباتات الزاحفة التي تزدهر في فصل الصيف مايو الى يوليو ومن اهمية الحنظل استخراج الزيت من البذور??? وهو زيت ثابت كثيرا ما يستخدم لعلاج الامراض الجلدية وكذلك الطفيلية الخارجية التي تصيب الماشية مثل جرب الجمال وانواع القراد المختلفة التي تصيب الحيوانات ذات الحافر المشقوق ويستعمل ايضا طاردا لحشرة العثة التي تضر الملبوسات الصوفية والقطنية ويكثر استخدام ثمار نبات الحنظل في
الطب الشعبي لعلاج روماتيزم المفاصل وبخاصة الثمار الطازجة???
ويستخرج من لب الثمار بعد فصل البذور عقار يحتوي على مواد قلوية لها تأثير مسهل شديد ويوجد به كحول متبلور يعرف باسم ستريلول ومادة جليكوسيدية تعرف باسم الالنزين??? ينمو الحنظل في الاراضي ذات الملوحة والقلوية المرتفعة والضعيفة والفقيرة الخصوبة كما انه ينمو جيدا في الاراضي الجرداء والمستصلحة حديثا وتجود زراعته في الاراضي الخفيفة خاصة الرملية منها والكلسية والاراضي الرملية المنخفضة ويقوم النبات بتجميع اكمات من التربة ولهذا النبات القدرة على اعطاء نمو خضري بدلا من الاجزاء المطمورة وازالة نبات الحنظل الذي يكون مثل هذه الاكمات سواء بالقطع او الرعي الجائر تنتج عنه تعرية للتربة وتدهور للبيئة من حيث النقص في كثافة الكساء النباتي???
يتطلب تحقيق الهدف الرئيسي لهذا البحث العمل على 4 مراحل هي: دراسة طبيعة نبات الحنظل وبيئته واهميته الاقتصادية وتحديد المعاملة المثلى لانشاء زراعات معقمة خالية من التلوث الميكروبي واختبار استجابة انسجة مختلفة من نبات الحنظل للاكثار النسيجي وتحديد اسلوب الاكثار النسيجي الامثل لنبات الحنظل وذلك باختبار اوساط غذائية ومنظومات هرمونية مختلفة???
النخيل والملوحة
وتضمن العدد كذلك عرضا لدراسة بعنوان: انتخاب وإكثار أصول موالح مقاومة للملوحة من اعداد الفريق البحثي: سلوى الكواري??? أمينة المالكي??? مها ال حنزاب??? د??? الفاتح محمد مهدي مختبر ذراعة الانسجة النباتية???
وتواترت مساعي الانسان في الماضي لتوفير الغذاء اما انسان اليوم فيسعى الى تحسين الانتاج النباتي??? وذلك يتطلب منه ايجاد حلول لكثير من المشاكل البيئية وأهمها مشكلة تملح الاراضي الزراعية الناتجة عن تراكم املاح الصوديوم والمغنسيوم??? وتعتبر الاراضي مالحة عندما يصل تركيز الملح في التربة الى مستوى يثبط نمو معظم نباتات المحاصيل??? وتهدف هذه الدراسة الى استخدام تقانة زراعة الانسجة النباتية في انتخاب نباتات موالح مقاومة للملوحة وذلك باستنبات بذور الموالح على اوساط غذائية ملحية (50???75???100???150???170???200 ملليمول كلوريد الصوديوم)??? ومن ثم تنمية اجزاء من سيقانها وبراعمها على الوسط الغذائي MS المضاف اليه السيتوكينين كاينتين والاكسين IAA بتراكيز (0???1??? 2???4 ملجم/لتر) لاكثارها بأسلوب التعضي??? ومن ثم تجذير النموات الخضرية واختبار ثبات صفة مقاومة الملوحة داخل الانابيب وفي البيت المحمي وفي الحقل???
ومشكلة تملح الاراضي الزراعية من اهم وأكبر المشاكل البيئية في عصرنا الحالي وهي ناتجة عن تراكم املاح الصوديوم??? مثل: كلوريد الصوديوم??? كربونات الصوديوم??? كبريتات الصوديوم وكذلك املاح المغنسيوم (الهلالي 1999)??? وتعتبر الاراضي مالحة عندما يصل تركيز الملح في التربة الى مستوى يثبط نمو معظم نباتات المحاصيل كما تتخذ مشكلة الملوحة طابعا عالميا???
ولقد سعى الدارسون لايجاد حلول لمشكلة الملوحة لعدة اسباب منها:
1- تزايد الكثافة السكانية على سطح الكرة الارضية مما يستدعي ضرورة التوسع الزراعي وتوفير الغذاء للانسان???
2- تراكم الاملاح في الاراضي الزراعية الى درجة تؤثر على نمو النباتات مما أدى الى تحويلها الى اراض غير صالحة للزراعة???
3- تزايد نسبة الاملاح في مياه الري نتيجة لتسرب ماء البحر الى الآبار الساحلية???
كما هدفت الدراسات السابقة في هذا المجال الى تحسين الانتاج النباتي واستنباط اصناف جديدة من المحاصيل ذات القدرة على
مقاومة الملوحة??? كذلك درس الباحثون تأثير الاملاح على نمو النبات وميكانيكية مقاومة النبات للأملاح??? ومن الجدير بالذكر ان هذه الدراسات قد توصلت الى حلول عديدة لمشكلة الملوحة منها:
1- ابعاد أو غسل الاملاح المتجمعة في منطقة نمو الجذور??? باستخدام كميات كبيرة من ماء الري???
2- استخدام مواد حامية من الاسموزية العالية لتطوير قدرة النباتات على مقاومة الملوحة???
3- إحداث طفرات جينية في النباتات لجعلها تنتج المواد الحامية من الاسموزية بكميات كافية لمقاومة الملوحة (Le Rudulier 1987)???
4- استنباط أنواع جديدة من المحاصيل المقاومة للملوحة من خلال استخدام الأساليب التالية???
{ الانتخاب المباشر من بين النباتات النامية والتي تظهر تحملا للملوحة???
{ استخدام الهندسة الوراثية في نقل صفة تحمل الملوحة (Wyn Jones and Gorham 1983)???
{ الانتخاب باستخدام تقانة زراعة الانسجة النباتية (Bouharmount 1990)???
وتهدف هذه الدراسة إلى استخدام تقانة زراعة الانسجة النباتية في انتخاب نباتات موالح مقاومة للملوحة وذلك باستنبات بذور الموالح على اوساط غذائية ملحية (50??? 75??? 100??? 150??? 170??? 200 ملليمول كلوريد الصوديوم)??? ومن ثم تنمية اجزاء من سيقانها وبراعمها على الوسط الغذائي MS المضاف إليه السيتوكينين كاينتين والاكسين IAA بتراكيز (0??? 1??? 2??? 4 ملجم/لتر) لاكثارها بأسلوب التعضي??? ومن ثم تجذير النموات الخضرية واختبار ثبات صفة مقاومة الملوحة داخل الانابيب وفي البيت المحمي وفي الحقل???
استخدام الهندسة الوراثية فى انتاج نباتات كوسة مقاومة للفيروسات

يعتبر فيروس التبرقش الأصفر الزوكينى (ZYMV) من أخطر الفيروسات التي تصيب نباتات العائلة القرعية وخاصة نبات الكوسة حيث يؤثر علي انتاجية هذه المحاصيل بنسبة تتراوح ما بين 40-80% مما يهدد المساحة المنزرعة بأصناف الكوسة والتى تقدر بمائة الف فدان وفقا للاحصائيات،
ولهذا الفيروس عدة سلالات أكثرها خطورة هى السلالة المصرية. ومن المعروف أن مقاومة هذا الفيروس الخطير بالطرق التقليدية قد ثبت عدم فاعليتها فى الحد من خطورته وانتشاره .ومع ظهور تقنيات الهندسة الوراثية وإمكانية نقل الجينات من كائن لآخر وتطورعلم الفيرولوجي واستخدامه في دراسة جينوم الفيروسات، فقد أدى ذلك الى ظهور استراتيجيات مختلفة لانتاج نبـاتات مقاومة للفيروس والتي منها نقل جين الغلاف البروتينىCoat protein (cp) gene الخاص بالفيروس الى النبات .وقد استطاع الفريق البحثى فى "معمل نقل الجينات GTL " بمعهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية AGERI ، التابع لمركز البحوث الزراعية، انتاج نباتات كوسة مقاومة لفيروس ZYMV وذلك باستخدام استراتيجية جين الغلاف البروتينى cp gene .

التجارب المعملية
بدأ الفريق البحثى بتأسيس نظام إعادة التمايز(Regeneration system) لصنف الكوسة "اسكندرانى" وبذلك تمكنوا من الحصول على نباتات كاملة فى المعمل عن طريق زراعة الانسجة، كما تم عزل جينوم الفيروس الخاص بالسلالة المصرية (ZYMV-Eg isolate) وكلونة الجين المسئول عن انتاج الغلاف البروتينى لادخاله فى نباتات الكوسة وذلك بالتعاون مع معمل أمراض النبات الجزيئي "MPPL" بالمعهد .
تلى ذلك نقل هذا الجين الى نباتات الكوسة لانتاج نباتات معدلة وراثياTransgenic plants ثم التأكد من وجود وتعبير الجين داخل النباتات الناتجة وذلك باجراء اختبارات معملية متخصصة مثل PCR كاختبار جزيئى، و ELISA كاختبار سيرولوجى.
تقييم النباتات داخل الصوب والحقول
قام الباحثون بتقييم مدى مقاومة تلك النباتات لفيروس (ZYMV) تحت ظروف الصوب البلاستيكية وذلك باحداث عدوى ميكانيكية باستخدام العصير المستخلص من نباتات مصابة بالسلالة المصرية من الفيروس، مع إنتخاب افضل النباتات من حيث درجة المقاومة للفيروس وصفات جودة الثمار.
وقد تم اختيار النباتات الأكثر تحملا للاصابة الفيروسية لتقييمها تحت ظروف الحقل المفتوح لمدة جيلين متتاليين، وشمل التقييم مدى قدرة النباتات على مقاومة فيروس (ZYMV) حيث تأخر ظهور الأعراض المميزة للفيروس بعد فترة تراوحت بين10 الى 13 أسبوع من الزراعة، وكانت أعلى نسبة اصابة بالفيروس 4 -8% فى النباتات المعدلة وراثيا ، بينما كانت 60-80% فى النباتات غير المعدلة وراثيا، كما تم تقييم الخواص البستانية للنباتات من حيث جودة الثمار ومدى ملائمتها لعملية التسويق .
تقييم سلامة الغذاء على الانسان والبيئة
وجدير بالذكر أن تلك التجارب المعملية والحقلية لانتاج نباتات كوسة معدلة وراثيا مقاومة لفيروس التبرقش الاصفر الزوكينى قد بدأت منذ عام 1994 واستمرت الى الآن ، وهى مدة كافية للتأكد من ثبات صفة مقاومة تلك النباتات للفيروس. وحاليا يتم اجراء اختبارات أخرى على تلك النباتات تتعلق بسلامة الغذاء وتأثيره على البيئة وذلك فى معامل متخصصة، يلى ذلك عرض نتائج تلك الاختبارات على لجنة الأمان الحيوى لتقرر مدى صلاحية أصناف الكوسة المعدلة وراثيا للتداول والتسويق.

انتاج أصناف أرز معدل وراثيا مقاوم لمرض لفحة الأرز
تعد مصر من الدول القليلة التى تنتج محصولا عاليا من الأرز، وتنتمى أغلب أصناف الأرز المصرى الى Oryza sativa، ويزرع فى مصر سنويا 1.2 مليون فدان، يعطى محصولا يقدر بحوالى 3.5 مليون طن، ويقدر اجمالى الدخل القومى من الأرز بحوالى 801.5 مليون جنيه سنويا.
ويتعرض محصول الأرز فى مصر للاصابة بمرض لفحة الأرز Rice blast الذى يسببه الفطرPyricularia grisea محدثا اصابات شديدة تؤثر على انتاجية المحصول، وبالرغم من انتاج أصناف مقاومة لفطر لفحة الأرز بطرق التربية التقليدية، واستخدام المبيدات المكافحة للفطر، الا أن مقاومة هذا الفطر مازالت تمثل مشكلة خطيرة نظرا لقدرته العالية على التغيير .
لذلك كانت هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجية جديدة لمقاومة هذا الفطر وتتمثل فى انتاج أصناف من الأرز مهندسة وراثيا مقاومة لفطر لفحة الأرز.

التجارب المعملية
- التعرف على بروتينات دفاعية مقاومة للفطر من نباتات لها القدرة على تثبيط نمو الفطر تتبع عائلة الكايتينيز Chitinase.
- عزل جين بروتين الكايتينيز Chitinase gene المقاوم للفطر من أصناف الأرز الناتجة وكلونته.
- انتاج بروتين الكايتينيز فى البكتيريا وتنقيته لاجراء اختبارات السمية معمليا على بيئة صناعية لمعرفة قدرته على مقاومة فطر لفحة الأرز.
- نقل وتعبير هذا الجين فى أجزاء نباتية لأصناف الأرز المصرية لانتاج أصناف مقاومة لمرض لفحة الارز.
- اعادة التمايز للأجزاء النباتية المهندسة وراثيا الحاملة للجين واختبار نشاط هذا الجين وقدرته على مقاومة الفطر، ومقارنة نشاطه
بنشاط بروتين الكايتينيز.
- بعد التأكد من نشاط بروتين الكايتينيز ومقاومته للفطرفى أصناف الأرز المعدله وراثيا يتم اكثار النباتات بطرق زراعة الأنسجة.
- بعد نجاح التجارب والاختبارات معمليا وداخل الصوب، يستعد حاليا الباحثون لاجراء الاختبارات الحقلية.
تخضع التجارب والأبحاث المتعلقة بالتكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية فى المعامل وداخل الصوب أو عند اجراء الأختبارت الحقلية الى تطبيق "القواعد الارشادية" االتى أقرتها لجنة الأمان الحيوى، وهى اللجنة المسئولة عن تقييم المحاصيل المعدلة وراثيا ومعرفة مدى تأثيرها على كل من الانسان والحيوان والبيئة من خلال تقييمها لاختبارات معملية متخصصة يتم اجراؤها على تلك المحاصيل، كما تقوم اللجنة بالتصديق على تلك المحاصيل بعد التأكد من سلامتها وتصرح بتداولها فى الأسواق.

إنتاج أصناف شعير معدلة وراثيا تتحمل الضغوط البيئية
ان تطوير سلالات من الشعير باستخدام الهندسة الوراثية قادرة على تحمل الضغوط البيئية القاسية يمكن أن يؤدى الى مضاعفة انتاجية الفدان وهو مايمثل اضافة دخل قدره 250 مليون دولار الى المزارعين وبالتالى الى الدخل القومى، الأمر الذى يؤدى الى تشجيع المزارعيين والقطاع الخاص على استصلاح المزيد من الأراضى الصحراوية. لذا كان ينبغى تعريف أصناف الشعير المصرية على المستوى الجزيئى تم عمل نظام اعادة التمايز لها، وتلك كانت الخطوات الرئيسية للمشروع البحثى على نبات الشعير.

المشروع البحثى :
أولا : حصر التنوع الوراثى لبعض أصناف الشعير باستخدام تقنية البيولوجيا الجزيئية
تم تعريف وتمييز عدد كبير من أصناف الشعير ودراسة العلاقة بين تلك الأصناف من خلال اجراء التجارب التالية :
- دراسة صفات مكونات المحصول من حيث طول النبات والسنبلة وعدد الحبوب فيها ووزن المائة حبة ومساحة الورقة.
- اجراء التفريد الكهربى للبروتينات باستخدامIEF or SDS-PAGE ، حيث وجدت حزم بروتينية ميزت كل صنف على حدة ، كما تم اجراء
التفريد الكهربى لمشابهات الانزيمات.
- استخدام تقنية RAPD-PCR أدى الى عمل بصمة وراثية لكل صنف الى جانب دراسة درجة القرابة من حيث التماثل والاختلاف بين
أصناف الشعير المختلفة مما يؤدى الى حصر التنوع الوراثى لأصناف الشعير المحلية المنزرعة فى مصر.
- التوصل الى معرفة الواسمات الجزيئية Molecular markers المميزة لكل صنف لسهولة الكشف عن الأصول الوراثية لأصناف الشعير .



ثانيا : نقل الجينات التى تتحمل الضغوط البيئيةلانتاج أصناف شعير معدلة وراثيا
1 - كلونة ودراسة التعبير الجينى للجينات الخاصة بمقاومة الاجهاد البيئى والجفاف وهى Bsrf41, Dhn3, Dhn9 and ABA related gene وذلك فى بكتريا
القولون E. coli
2 - عمل متراكبات جزيئيةConstructs Molecular لكل من الجينات Bsrf 41 Hava 1بغرض ادخالهم فى نبات الشعير .
3 - تأسيس نظام اعادة التمايز Regeneration systemفى نباتات الشعير باستخدام أجنة ناضجة وغير ناضجة معزولة من أصناف الشعير المنزرعة.
ويعكف الباحثون فى مركز بحوث الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية بجامعة عين شمس على تحقيق باقى أهداف المشروع البحثى لانتاج أصناف شعير معدلة وراثيا تتحمل الضغوط البيئية مما يساعد على غزو الصحراء وزراعة الاراضى الصحراوية تحت ظروف الاجهاد البيئى .

استخدام الهندسة الوراثية لانتاج نباتات قمح تتحمل الجفاف
يهدف هذا البحث المشترك بين كلية الزراعة بجامعة عين شمس ومعهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية بمركز البحوث الزراعية الى انتاج نباتات قمح معدلة وراثيا تتحمل الجفاف وذلك عن طريق نقل جين فركتان fructan-accumulating gene (cpy/sacB) من البكتيريا الى نباتات القمح .

التجارب المعملية
تم ادخال جين فركتان والجين الواسم (bar gene) الى نباتات القمح المصرى صنف جيزة 164 باستخدام طريقة القذف الجينى، وتتضح أهمية الجين الواسم فى تحديد وانتخاب النباتات التى حدث فيها التعديل الوراثى حيث يتميز بمقاومة أحد مبيدات الحشائش (Basta)، وقد أدى استخدام هذا المبيد (Basta, 1 g/L) الى انتخاب النباتات التى أظهرت تعبيرا عاليا للجين الواسم، وتلك النباتات تم استخدامها لاستكمال التجارب اللاحقة.
تم اجراء التحليل الجزيئى لجين فركتان والجين الواسم من حيث وجود واندماج ووظيفة كل منهم، وذلك باستخدام
تقنيات RT-PCR,Southern,PCR للنباتات الناتجة T0 وحتى نباتات الجيل الأول T1.

التجارب داخل الصوب
تهدف تلك التجارب الى معرفة مدى تحمل النباتات المعدلة وراثيا لضغط الجفاف وذلك باجراء تقييم لنباتات الجيل الاول T1 ومقارنتها بنباتات قمح غير معدلة وراثيا. وقد قسمت النباتات المعدلة وراثيا الى مجموعتين، تم رى احداها بالمعدل الطبيعى من المياه (140 سم3 / أصيص) ، بينما تعرضت المجموعة الأخرى لضغط الجفاف حيث تم ريها بحوالى 40% فقط من احتياجاتها المائية. وقد أوضحت الاحصائيات أن النباتات المعدلة وراثيا من الجيل T1 كانت فى حالة جيدة عند ريها طبيعيا بالمياه وأيضا تحت ضغط الجفاف. ومما سبق يتضح أن جين فركتان المنقول الى نباتات القمح قد أظهر تحملا عاليا لضغط الجفاف. واستمرارا لهذا البحث، وبعد نجاح تجارب الصوب يستعد الباحثون لاجراء التجارب الحقلية مع الالتزام بتطبيق القواعد الارشادية للأمان الحيوى وذلك لانتاج نباتات قمح معدلة وراثيا تحتوى على جين فركتان تتحمل الجفاف وبالتالى يمكن زراعتها فى مناطق تعانى نقص المياه كالمناطق الصحراوية.
انتاج نباتات قمح معدلة وراثيا تتحمل الجفاف
يعتبر القمح أحد أهم المحاصيل التى يتغذى عليها الإنسان، فهو المحصول الرئيسى لانتاج الخبز والمكرونة، كما يستخدم التبن الناتج منه كغذاء للحيوان، لذلك توليه الدولة اهتماما خاصا فتعمل على زيادة انتاجيته فى الأراضى القديمة وزراعته فى الأراضى الجديدة والمستصلحة .
وهناك محاولات لسد الفجوة الغذائية لهذا المحصول فى المنطقة العربية باستخدام طرق التكنولوجيا الحيوية الحديثة لاستزراع مساحات من الأراضى الفقيرة حديثة الاستصلاح التى يقل فيها المحتوى المائى المتاح للنبات العادى. وأوضحت الدراسات الحديثة فى مجال بحوث الهندسة الوراثية أنه من الممكن نقل جينات من انواع مختلفة من النباتات إلى نبات القمح للحصول على صفات محصولية مرغوبة مثل صفة تحمل الجفاف.

التجارب المعملية
تم إدخال جين الـ HVA1 المعزول من الشعير إلى أحد أصناف القمح الربيعية المنزرعة بإستخدام قاذفة الجينات Gene gun وذلك لزيادة قدرة نباتات القمح على تحمل الجفاف. وهذا الجين يشفر لأحد البروتينات التى تتكون مع نهاية مرحلة نضج الجنين Late Embryonic Abundant Proteins (LEA) ويساعد على تحمل الجنين لنقص الماء أثناء مرحلة صلابة الحبة. كما تم إدخال جين الـ bar المسئول عن مقاومة أحد مبيدات الحشائش المسمى Basta كدليل لانتخاب الخلايا المعدلة وراثيا أثناء مراحل زراعة الأنسجة المختلفة، واختبار نقاوة التركيب الوراثى للجين الأساسى فى الأجيال المتعاقبة .
وعلى المستوى الجزيئى تم التأكد من وجود وتعبير هذا الجين فى عشرة نباتات مختلفة، ومن نسل تلك النباتات تم عمل تجربة مصغرة فى الصوبة لانتخاب أفضل النباتات المتحملة للجفاف بغرض اختبارها على مستوى الحقل.
التجارب الحقلية
- تم إجراء ستة تجارب حقلية لثلاثة أجيال من نباتات القمح المعدلة وراثياً مقارنة بالصنف الأصلى المنزرع غير المعدل وراثياً. وخلال الموسم الأول والثانى كانت النباتات المعرضة للإجهاد البيئى تروى مرة واحدة فقط خلال موسم النمو بعد الإنبات، بينما تم رى نباتات المقارنة ثمانية مرات طوال موسم النمو وهو المعدل الطبيعى لرى نباتات القمح. وفى الموسم الثالث تم إجراء تجربة حقلية تحت الزراعة المعتمدة على الأمطار فى أربعة مواقع صحراوية تتفاوت فى معدل نزول الأمطار بها.

- أظهرت النتائج فى الموسم الاول والثانى عدم وجود فروق معنوية فى محصول الحبوب وغيره من الصفات المحصولية بين نسل النباتات المعدلة وراثياً المنزرعة تحت ظروف الإجهاد البيئى وتلك المنزرعة تحت ظروف الرى العادية. كذلك أظهرت نتائج الموسم الثالث بالنسبة للمحصول البيولوجى "وزن النبات الكامل" ومحصول الحبوب تفوق نسل أحد النباتات المعدلة وراثيا تحت ظروف رى الأمطار على مثيله غير المعدل وراثياً. وجارى نقل هذا الجين بطرق التربية التقليدية إلى عدد من أصناف القمح المنزرعة عالية الانتاج مثل (جيزه 164 ، جيزه 168 ، سدس 1 ) .
وسوف تقوم لجنة الأمان الحيوى وهى اللجنة التى تنظم استخدام التكنولوجيا الحيوية فى مصر بتقييم نتائج اختبارات سلامة الغذاء ، ومن ثم يتم إجازته للتداول فى الأسواق .


انتاج نباتات موز معدلة وراثيا مقاومة للفيروسات

يعتبر الموز من أهم المحاصيل فى الدول النامية الاستوائية وشبه الاستوائية، وتعد مصر الدولة الرابعة فى إنتاج الموز حيث تقدر المساحة المنزرعة بحوالى 49,294 فدان، وتعطى انتاجا يقدر بحوالى 849,293 طن. ومن الملاحظ أن إصابة المحصول بالفيروسات يؤدى الى انخفاض كبير فى إنتاجية الفدان نظرا لقدرة الفيروسات على الانتشار السريع بواسطة الحشرات خاصة فيروس تورد القمة في الموز (BBTV).
ومقاومة تلك الفيروسات سواء كان باستخدام المبيدات لمقاومة الناقل الحشرى أو استخدام تقنية زراعة الأنسجة لإنتاج نباتات خالية من الفيروس لم تؤدى الى تحقيق النتائج المرجوة، لذلك أصبح إنتاج نباتات موز معدلة وراثيا مقاومة لتلك الفيروسات هو الحل الأمثل لمقاومتها وزيادة إنتاج الموز .



وقد قامت كلية الزراعة بجامعة الاسكندرية بالتعاون مع معهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية AGERI بإنتاج نباتات موز معدلة وراثيا مقاومة لبعض الفيروسات وفيما يلي موجز عن المشروع البحثى وما تم انجازه فى هذا الشأن .


أهداف البحث :
إنتاج نباتات موز معدلة وراثيا تحتوى على جين الغلاف البروتينى لكل من الفيروسات التالية:
- فيروس الـBBTV والذي يسبب مرض تورد القمة في الموز (BBTD).
- فيروس الموزيك في الموز(Banana–CMV) والذى يسبب مرض الموزيك فى الموز (BMD)


ويتم ذلك باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة والهندسة الوراثية باتباع الخطوات التالية :

جمع العينات والتأكد من الفيروسات
تم جمع عينات من نباتات موز بها أعراض الاصابة بأمراض تورد القمة والموزيك، ثم التأكد من وجود تلك الفيروسات باستخدام سيرم مضاد متخصص لهما باستخدام تقنية إليزاELISA .

عزل الجينات وتجهيز المتراكبات الوراثيةGene Constructs
- تم عزل جينات الغلاف البروتينى لكلا الفيروسين (BBTV & Banana-CMV) وذلك باستخدام إحدى تقنيات البيولوجيا الجزيئية وهى
PCR و RT-PCR.
- تم كلونة الجينات موضع الدراسة على حده في إحدى البلازميدات
- وإدخالها في بكتريا القولون المعروفة باسم E. coli، ثم عزل الحمض النووى
للبلازميدات ودراسة التتابع النيوكليوتيدى لتلك الجينات.
- بعد التأكد من التعبير الجينى فى البكتريا، تم عمل كلونة باستخدام ناقل التعبير النباتى حتى تكون الجينات قادرة على التعبير عن نفسها داخل خلايا
نباتات الموز .


تأسيس نظام التحول الوراثى
تم تأسيس نظام التحول الوراثى لصنف الموز وليامز باستخدام تقنية الدفع الجينى عن طريق استخدام جينات الـgus و bar .
إدخال الجينات وأقلمتها تحت ظروف الصوب
تم إدخال جينات الغلاف البروتينى لكلا الفيروسين بصورة منفصلة فى صنف الموز وليامز واستكمال خطوات إعادة التمايز للحصول على نباتات كاملة ثم أقلمتها تحت ظروف الصوب.


الكشف عن الجينات فى نباتات الموز المعدلة وراثيا
تم الكشف عن وجود وتعبير الجينات موضع الدراسة باستخدام تقنيات الـ PCR و ELISA وWestern blot .

تقييم النباتات المعدلة وراثيا تحت الظروف الحقلية
بعد التأكد من نجاح التعبير الجينى لجين الغلاف البروتينى لكلا الفيروسين داخل خلايا نباتات الموز المعدلة وراثيا، يتم حاليا تقييم قدرة تلك النباتات على مقاومة الفيروسات – موضع الدراسة - فى حقل منعزلContained field trail وفى وجود نباتات غير معدلة وراثيا ومصابة بهذه الفيروسات
(كمصدر للاصابة الفيروسية) بجانب عدم استخدام أى مبيدات لمقاومة الحشرات الناقلة لتلك الفيروسات.




التكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية بالمركزالقومى للبحوث
تم إنشاء شعبة التكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية بالمركز القومى للبحوث NRC عام 1985 وتتكون الشعبة من تسعة أقسام تغطى عدة مجالات منها الزراعية والطبية والصناعية والبيئية، ونركز فى هذا العدد على التكنولوجيا الحيوية فى مجال الزراعة والغذاء ومن أهمها:-

1- وضع بروتوكول تطبيقى للإكثار المعملى للأصناف المتميزة من نخيل البلح باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة.
2- دراسة طرق إنتاج نباتات بطاطس معدلة وراثيا مقاومة لبعض الأمراض الفيروسية، كما يجرى حاليا نقل جين "دفنسينDefinsin " الى النباتات
لمقاومة بعض الأمراض الفطرية.
3- إنتاج العديد من المركبات الدوائية من مزارع الخلايا المعلقة للنباتات الطبية المصرية باستخدام المفاعلات الحيوية.
4- إنتاج نباتات الموز وبعض نباتات أزهار القطف وعمل تحاليل البيولوجيا الجزيئية على نطاق تجارى.
5- تم معمليا إنتاج نباتات فول مهندسة وراثيا تحتوى على الجين المسئول عن إنتاج الحمض الأمينى Methionine وذلك لتحسين القيمة الغذائية للفول
من حيث محتواها من الأحماض الأمينية الكبريتية.


إنتاج نباتات فول معدلة وراثيا ذات قيمة غذائية عالية
تعتبر بذور الفول وجبة أساسية هامة لملايين السكان فى مصر نظرا لاحتوائها على نسبة عالية من البروتين، ولسوء الحظ ان هذا البروتين تنقصه بعض الأحماض الأمينية الضرورية مثل حمض (ميثيونينmethionine ) و(سيستينcysteine ) كما أن نقص عنصر الكبريت الموجود فى الحمض الأمينى يحد من القيمة العذائية للفول مما قد يسبب إعاقة جسدية وعقلية عند الأطفال بسبب نقص الأحماض الأمينية الضرورية فى وجباتهم.
ولم تتمكن برامج التربية التقليدية من حل تلك المشكلة، بينما وجد العلماء أملا فى تحسين القيمة الغذائية لبذور الفول باستخدام الهندسة الوراثية، خاصة ان هذا الأمر قد أثبت نجاحا فى محاصيل أخرى مثل الأرز.

التجارب المعملية:
- تم إدخال الجين المشفر للألبيومين الغنى بالكبريت المأخوذ من نبات عباد الشمس (SFA8) الى جينوم نبات الفول بواسطة المحفز(B4)
الخاص بهذا النبات البقولى والذى يحدث تعبيرا خاصا فى بذور الفول.
- تم التأكد من وجود الجين المنقول وقدرته على التعبير فى نباتات الفول بواسطة التحليل الجزيئى.
- أوضح تحليل الحمض الأمينى لبذور الفول مدى تعبير الجين فى النباتات المهندسة وراثيا.
- أثبت التحليل إحتواء بذور الفول المعدلة وراثيا على الحمض الأمينى (ميثيونين) بنسبة 0.76 % من البروتين الخام للبذور، وتلك النسبة
تمثل زيادة مقدارها 15.1 % من الميثيونين الكلى الموجود فى البذرة مقارنة بالأصناف التقليدية، بالإضافة الى تزايد نسبة الحمض الأمينى
(سيستين) فى تلك البذور بنسبة 23% مقارنة بالأصناف التقليدية.

يعد الآن الفريق البحثى طلبا لتقديمه الى اللجنة القومية للأمان الحيوى للحصول على تصريح بزراعة بذور الفول خارج المعمل (تحت ظروف منعزلة) وذلك لمراقبة ورصد البروتين الغنى بالكبريت فى بذور الفول لأجيال متعاقبة.



إستخدام نباتات الذرة المعدلة وراثيا لإنتاج لقاح للوقاية من الالتهاب الكبدى بفيروس B
إستطاع فريق من العلماء بمعهد بحوث الهندسة الوراثية الزراعية- مركز البحوث الزراعية إجراء اختبارات لإستخدام النبات كمصنع حيوى لانتاج لقاح للوقاية من مرض الإلتهاب الكبدى بفيروس ب HBsAg، والذي يعتبر من أكثر الأمراض الفيروسية إنتشارا حيث يصيب حوالى 350 مليون شخص فى العالم مسببا إصابات خطيرة وإلتهابا حادا ومزمنا وأيضا أورام سرطانية فى خلايا الكبد، لذا أصبحت هناك حاجة ملحة لإنتاج وتطوير لقاح فعال للوقاية من هذا المرض الخطير.
وفى كثير من مناطق العالم النامى يعد إرتفاع تكلفة اللقاحات عائق أمام العديد من السكان، وقد أدى ذلك إلى محاولة الحصول على الجين المسؤل عن إنتاج أجسام مضادة لفيروس B المسبب لمرض الإلتهاب الكبدى ونقله إلى النبات لإنتاج لقاح منخفض التكلفة وسهل الاستخدام وفى متناول المرضى.
ويتم إختيار النبات لإنتاج اللقاح وفقا لمعايير علمية وإقتصادية، لذلك استقر الاختيارعلى محاصيل الحبوب خاصة الذرة نظرا لإحتوائه على نسبة عالية من البروتين وايضا لقدرته العالية على التعبير عن البروتين المستخدم فى إنتاج اللقاح، فضلا عن أن حبوب الذرة المعدلة وراثيا يمكن حفظها لفترة طويلة كما يتم استهلاكها مباشرة أوعلى شكل دقيق.




قراءة
 هذا الموقع برعاية
الصفحة الرئيسية | عن كنانة | أسئلة متكررة | خريطة الموقع | اتصل بنا
كنانة أونلاين - الصندوق المصرى لتكنولوجيا المعلومات و الاتصالات © 2006